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順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10

發布時間: 2019-01-21
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景杰編者按:

AMPK是細胞內能量穩態的關鍵調控因子,盡管關于AMPK在細胞過程中的功能已被廣泛研究,但是AMPK是否還存在新的下游底物以及下游功能調控網絡對細胞命運以及疾病發生發展的影響?現在知道的并不完全。

為了探究AMPK依賴的信號通路調控,來自美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心實驗放射腫瘤中心陳俊杰(Junjie Chen)研究團隊運用定量磷酸化蛋白質組學分析了AMPK野生型和AMPKα1/α2雙敲除的細胞系內的蛋白組變化,共鑒定到160個AMPK調控的磷酸化位點。進一步分析發現,AMPK可以在體內體外磷酸化一個新的底物蛋白ARMC10 S45位點。ARMC10過表達能夠促進線粒體分裂,但是ARMC10敲除能有效的抑制AMPK介導的線粒體分裂。


順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10?

研究結果證明ARMC10是AMPK下游新的底物并參與到AMPK介導的線粒體分裂和融合的動力學調控過程中,為揭示AMPK調控細胞過程新的機制提供思路。研究成果于2019年1月10日在線發表在國際專業學術期刊Nature Communications上,是一篇運用質譜依賴的修飾組學技術尋找已知蛋白下游互作因子以及信號調控網絡與生理功能的經典范例。


順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10

研究對象:AMPK依賴的信號通路調控

實驗樣本:HEK293A, HEK293T and U2OS等腫瘤細胞系

發表期刊:Nature Communications(IF=12.353)

發表單位:德克薩斯大學 M. D. Anderson 癌癥中心

發表時間:2019.01.10





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研究背景
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AMPK(AMP-activated protein kinase)是一類激酶復合物,在真核生物細胞能量穩態過程中發揮關鍵功能。AMPK能夠監測細胞內ATP的水平,當AMP:ATP和ADP:ATP的比例增加時,AMPK被活化進而調控下游多種通路的酶活性來控制能量穩態。AMPK活化葡萄糖吸收和分解代謝,促進ATP的產生;關閉合成代謝,抑制ATP的消耗。同時,ATP還能調控mTOR,后者能通過抑制自噬和凋亡來調控細胞增殖。

作為細胞過程中重要的調控因子,AMPK在多種疾病過程如癌癥、糖尿病等發生發展中也發揮重要功能。因此,臨床上已經開發了多種調控AMPK信號通路的化合物來治療疾病,比如研究活化AMPK的二甲雙胍,作為潛在的抗腫瘤藥物在臨床上使用。

鑒于AMPK在生理和病理中如此重要的功能,因此進一步挖掘AMPK下游的調控底物對于理解AMPK的功能以及疾病治療上的應用具有非常高的價值。



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研究速讀
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1. 磷酸化蛋白質組學篩選AMPK下游底物

首先,作者運用CRISPR-Cas9基因編輯技術將AMPKα1/α2進行雙敲除,并通過Western blotting對敲除效果進行驗證。接下來運用SILAC標記的定量磷酸化蛋白質組學技術對WT組細胞系和敲除組細胞系進行實驗(圖1)

順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10

圖1?磷酸化蛋白質組學篩選鑒定AMPK下游底物


2.?磷酸化蛋白質組學結果分析

生物信息學分析顯示共鑒定到9122個磷酸化肽段;進一步分析發現,WT細胞組和AMPKα1/α2-DKO細胞組相比,共有109個磷酸化位點上調,51個磷酸化位點下調(圖2a)。

為了在磷酸化蛋白質組學數據中篩選AMPK的潛在底物,作者將WT細胞組中109個上調磷酸化位點根據AMPK保守的底物序列分成兩組,group1中32個磷酸化位點具有AMPK一致性序列,group2中77個磷酸化位點無AMPK一致性序列(圖2b),WT組中下調的51個磷酸化位點被分成group3。

通過IPA(Ingenuity Pathway Analysis)對三組蛋白進行功能分析(圖2c),結果顯示,group1為AMPK直接調控的潛在底物,在胞質過程如代謝、細胞結構重組、線粒體分裂等過程中發揮功能。Group2、group3為AMPK間接調控的潛在底物,主要參與細胞核中包括轉錄、翻譯、細胞周期、DNA修復等過程。

順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10

圖2?磷酸化蛋白質組學數據分析


3.?ARMC10是AMPK新的調控底物

為了在實驗上驗證AMPK新的調控底物,作者選取了排名最前的ARMC10(Armadillo repeat containing?protein 10,alternative name SVH, specific?splicing variant involved in hepatocarcinogenesis))進行pulldown實驗(圖2d,驗證AMPK和ARMC10的結合)和體外激酶實驗(圖2e,驗證AMPK對ARMC10的磷酸化),結合后續的S45磷酸化特異性抗體實驗證明,AMPK確實可以磷酸化ARMC10的S45位點。

順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10

圖3?AMPK底物驗證


4.?AMPK通過下游底物ARMC10調控線粒體動力學和細胞存活

在確認了ARMC10定位在線粒體并參與線粒體分裂后,為了進一步探究AMPK介導的ARMC10磷酸化對線粒體動力學以及細胞功能的影響,作者通過在篩選的U2OS穩定細胞中進行免疫熒光實驗。結果顯示,AMPK磷酸化ARMC10后促進線粒體分裂(圖4a,4b)

已有的研究表明線粒體分裂、融合與細胞生存密切相關,進一步通過生存實驗發現,AMPK介導的ARMC10磷酸化促進細胞存活(圖4c, 4d)。

順藤摸瓜,磷酸化組學尋找AMPK關鍵下游互作因子ARMC10?

圖4 AMPK通過下游底物ARMC10調控線粒體動力學和細胞存活


5.?蛋白互作組揭示ARMC10調控線粒體動力學的機制

為了探究ARMC10在線粒體調控過程中的具體機制,作者通過BioID技術進行蛋白互作的分析。在構建了BioID2-ARMC10穩定細胞系后進行BioID2-MS實驗。實驗結果顯示,ARMC10作用的蛋白包括Drp1(調控線粒體分裂)、MEF,?MIEF1, MIEF2(調控Drp1招募到線粒體)、MTFR1, MTFR2(線粒體分裂調控因子)、BNIP3, BAX(介導線粒體功能紊亂和線粒體自噬)。以上的結果表明,ARMC10可能通過與MFF, FIS1, Drp1蛋白作用調控線粒體功能(圖5)

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圖5 AMPK磷酸化ARMC10 S45調控線粒體分裂的模型



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小結
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本篇文章是一篇運用質譜依賴的修飾組學技術尋找已知蛋白下游互作因子以及信號調控網絡與生理功能的經典范例。AMPK是細胞內廣為人知調控能量穩態的關鍵因子并與多種疾病如癌癥、糖尿病等發生發展密切相關。本文運用近年來非常熱門的CRISPR-Cas9技術結合定量磷酸化蛋白質組學分析,發現AMPK可以磷酸化一個新的底物蛋白ARMC10 S45位點并參與線粒體動力學和細胞生存,為揭示AMPK調控細胞過程中新的機制提供思路。

在基礎科研中,尋找激酶的下游底物是一項非常有挑戰的工作,而本文前期的篩選結果正是體現了蛋白質組學技術在基礎研究中挖掘下游互作蛋白和調控網絡機制的強大功能,對后續類似的科學研究具有非常重要的參考和指導意義。



陳俊杰教授課題組簡介:

陳俊杰教授,現任美國德克薩斯大學MD安德森癌癥中心實驗放射腫瘤中心主任。他是基因組穩定性,特別是DNA損傷應答通路和癌癥生物學方面的國際著名科學家。他本科畢業于復旦大學,后來在佛蒙特大學獲得博士學位,在哈佛醫學院Anindya Dutta 和David Livingston實驗室進行博士后訓練。

陳俊杰教授實驗室主要研究基因組不穩定性和腫瘤發生的分子機制。DNA損傷后的基因組完整性依賴于DNA修復和細胞周期檢查點控制的協作。DNA損傷反應通路的完整性對防止細胞惡性轉化,起到很重要的作用。

陳俊杰教授在發現DNA損傷通路的新組分上做出了許多重要貢獻。近年來他的研究開始涉及基因組不穩定性的其他領域,包括有絲分裂調控和細胞衰老,闡明了有絲分裂檢查點蛋白Chfr調控多種關鍵有絲分裂激酶,保證有絲分裂的進行。另外,他實驗室也研究去乙酰化酶SIRT1在衰老和腫瘤發生中的作用。


參考文獻:

Zhen Chen,?et al.?(2019),?Global phosphoproteomic analysis reveals?ARMC10 as an AMPK substrate that regulates?mitochondrial dynamics.?Nature Communications.



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組蛋白修飾密碼全景圖

(2018年12月版)

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