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重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學

發布時間: 2019-05-16
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重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學

景杰學術/報道


蛋白質組學為生命科學和醫學領域的進步起到了巨大的推動作用,但傳統的蛋白質組學技術仍面臨著檢測通量和定量穩定性等方面的諸多挑戰,而這些挑戰終于在近期迎來了方法學上的重大突破。


2018年12月蛋白質組學領域頂級期刊MCP在線發表了德國馬普生化研究所所長、世界著名蛋白質組學專家Matthias Mann教授最新的研究成果。該文章介紹了基于PASEF的timsTOF Pro質譜系統,該質譜采用了專有捕獲離子淌度(TIMS)技術,能實現更高速度、更高靈敏度、更強大的4D蛋白質組學分析,展現了其在蛋白質組學領域的強大功能和廣泛應用前景。


Graphical?Abstract

重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學


蛋白質組學研究對于理解生理條件下生命過程以及病理條件下疾病發生發展都具有非常重要的意義。Bottom-up蛋白質組學實驗流程主要包括前期的樣品制備、酶解肽段、色譜分離、質譜檢測、生信分析。在質譜檢測過程中,由于蛋白質組的復雜程度極高,而儀器的掃描速度有限,因此只能選擇相對強信號的離子進行檢測,但這個過程存在一定的隨機性并且會影響后續鑒定的蛋白通量。


盡管有研究表明在哺乳動物蛋白組研究上能夠實現蛋白組的深度覆蓋,但這個過程需要耗費大量的實驗投入包括樣品制備和檢測時間。同時,色譜分離中的共洗脫肽段也進一步加大了分析的難度,也使得許多低豐度蛋白信號被掩蓋而無法檢出。和基因組以及轉錄組技術相比,蛋白質組技術由于質譜掃描速度、靈敏度、通量等因素的限制導致其應用場景仍然受限。在過去的十幾年里,也正是因為這些技術的不足推動著質譜系統在速度和靈敏度上的不斷革新。


本篇研究介紹的就是近期取得重大突破的timsTOF Pro質譜系統,其所采用的PASEF技術在采集速度倍增的基礎上仍然保持高分辨率。而基于此衍生出的4D蛋白質組學方法,在不借助Spectral?library的基礎上,單針即可從極微量樣品中鑒定到超過6000個蛋白,因此特別適用于快速且高靈敏的蛋白質組學檢測,并為蛋白質組學技術在基礎研究和臨床轉化方面的應用帶來了全新的可能。


重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學
1
捕獲離子淌度TIMS與平行累積持續碎裂PASEF


捕獲離子淌度(TIMS)指的是在保留時間(?retention time)質荷比(m/z)分離的基礎之上增加了離子淌度( ion?mobility)新維度的分離,加上離子強度(intensity)構成了“4D蛋白質組”的四個維度。其中新引入的離子淌度,主要是根據分子的形狀和截面進行分離,能夠有效降低“混合譜圖”的比例。


Matthias Mann教授組結合一定的算法對肽段離子從m/z以及Ion mobility兩個維度進行分析鑒定。從結果中我們可以看到,在m/z維度上不能分離的肽段離子在新增的離子淌度維度上能夠被清晰的分離(圖1)


重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學?圖1. 肽段離子的捕獲離子淌度分離


研究中同時介紹了另一種新的技術應用,即平行累積持續碎裂PASEF(Parallel Accumulation Serial Fragmentation)技術(圖2)。基于timsTOF Pro運用的雙TIMS分離/富集裝置,離子在第一個TIMS部分中進行累積,然后在第二個TIMS中根據淌度進行分離,經過分離后的離子繼續用于MS/MS碎裂。隨后重復該步驟,在該過程中,當第二個TIMS進行分離時,第一個TIMS也同時在平行地累積離子,這樣可以實現近乎100%的離子利用率。


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圖2. TimsTOF Pro上實現平行累積連續碎裂(PASEF)


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2
? 定量準確性


在蛋白質組學研究中,一個關鍵的步驟就是對不同生物學重復樣本之間蛋白豐度進行準確定量,即所謂的“質控標準”。為了進一步分析timsTOF Pro對蛋白定量的準確性,研究者從皮爾森相關系數(Pearson correlation?coefficient)、中位數變異系數(median coefficients of variation)、缺失值(missing value)和定量準確度(quantitative accuracy)這四個統計角度進行分析。在2h、四次重復的條件下平均鑒定到5575個蛋白,重復性分析結果顯示皮爾森相關系數為0.979,表明實驗的重復性非常好(圖3A)。MaxLFQ歸一化以后,中位數變異系數為7.2%(圖3B)


進一步,研究者發現PASEF技術能夠顯著降低label-free缺失值的問題(圖3C)。為了進一步驗證timsTOF Pro定量準確性,研究者將Hela和大腸桿菌胰酶消化后的肽段混合并進行質譜分析,結果顯示95%的蛋白是能準確定位的,只有1.3%的蛋白被錯誤分類。展示了該方法高水平的定量準確性(圖3D)


重磅!Matthias Mann發文,基于捕獲離子淌度的新一代4D 蛋白質組學?圖3. Label-free蛋白組定量數據質控


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3
? 檢測速度和通量


為了驗證tims-TOF蛋白組定量檢測速度和通量,研究者采用了100ng、50ng、10ng的Hela細胞樣品并在1h、0.5h條件下進行實驗。結果顯示,100ng、50ng、10ng的樣品量在1h的條件下分別可以鑒定到4513、4215、2723個蛋白。30分鐘內10ng的Hela細胞能夠鑒定到2100個蛋白,而適當增大樣品量和梯度時間(2h)則可實現單針檢測超過6000個蛋白。這個結果表明TIMS-PASEF非常適用于快速且高靈敏度的蛋白質組學應用。


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圖4. Hela蛋白組速度和靈敏度的檢測


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4
? 小結


在這篇文章中,研究者介紹了最先進的整合了四級桿飛行時間、捕獲離子淌度(tims)以及平行累積連續碎裂(PASEF)掃描模式的全新質譜系統。Bruker timsTOF Pro以強大而靈活的方式成功地整合了這些模塊,不僅實現了基于PASEF操作的shotgun蛋白質組學,也使得許多其他操作模式的探索成為可能。


TimsTOF Pro采用了PASEF技術,帶來了掃描速度和靈敏度革命性提升并且極大的減少檢測時間和樣品量。本篇研究中,30分鐘內10ng的Hela細胞能夠鑒定到2100個蛋白,而適當增大樣品量和梯度時間則可實現單針檢測超過6000個蛋白。在提高掃描速度的同時,MS和MS/MS譜圖依然保持超高分辨率,這些獨特的性能,使其成為蛋白組學復雜樣本深入研究的利器。


新引入的離子淌度分離和高速采集速度,也標志著蛋白質組學正式進入“4D時代”。憑借4D蛋白質組學技術的高通量、高靈敏度和高準確性,研究者將能夠對復雜樣品的分子機制進行更深入的研究、提高發現低豐度生物學重要蛋白質的可能性,并在轉化醫學、臨床蛋白質組學等研究中具有廣泛的應用前景。


參考文獻

Florian Meier,?et al., 2018,?Online Parallel Accumulation–Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer.?Molecular & Cellular Proteomics.

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