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再次引領!酰化修飾新成員:賴氨酸苯甲酰化修飾

發布時間: 2018-09-12
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編者按

苯甲酸鈉是常見的食品添加劑,在蜜餞、果干、汽水中廣泛使用。此外苯甲酸鈉也是FDA批準的藥物,用于治療尿素循環紊亂導致的高血氨癥。雖然苯甲酸鈉被認為是相當安全的食品添加劑,但是近期也有其對健康不利的報道。同時,日本現在已經對苯甲酸鈉的使用作出限制,但是對于苯甲酸鈉影響健康的分子機制還未知。

近日,芝加哥大學趙英明教授課題組在國際著名期刊Nature?Communications上發表了題為“Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2”的論文,報道了迄今唯一的發生在組蛋白賴氨酸上,含有苯環的酰化修飾----苯甲酰化修飾(圖1),為蛋白質的翻譯后修飾研究開辟新的領域,也為評價目前食品添加劑的安全性提供了新思路。趙英明教授課題組的黃河博士為文章的第一作者,參與本研究的還有香港大學的郝權教授、喬治亞大學Y.?George?Zhen教授。

酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾


圖1. 苯甲酰化與乙酰化的比較




研究小結



苯甲酸鈉是被廣泛使用的食品添加劑,FDA允許在食品中不高于0.1%的添加量,同時苯甲酸鈉也被作為治療高血氨癥的藥物。有報道指出,攝入苯甲酸鈉可能會對人的健康產生傷害,用于治療目的的苯甲酸鈉若劑量不合適也會導致健康問題,但是對于苯甲酸鈉影響人類健康的分子機制的研究并不明朗。

近日趙英明教授發現了發生在賴氨酸上的新型修飾-----苯甲酰化修飾,運用生物質譜與生物化學的方法鑒定出位于組蛋白的22個賴氨酸可發生苯甲酰化修飾,該種修飾會受到苯甲酸鈉的激發,并受到SIRT2的調節。CHIP-Seq和RNA-Seq數據揭示出苯甲酰修飾主要集中在基因的啟動子上,且其生理功能與乙酰化并非完全相同,會通過影響基因表達水平調控響應的通路。



研究思路和成果



1.?組蛋白上賴氨酸苯甲酰化修飾的鑒定和驗證

作者提取了HepG2細胞的蛋白,進行胰蛋白酶酶解后,利用高效液相色譜-質譜聯用,得到質譜數據(圖2上)后,利用趙英明教授搭建的曾為無數翻譯后修飾的發現立下汗馬功勞的PTMap(Proc Natl Acad Sci U S A.?2009 Jan 20;106(3):761-6.)分析數據,在H2B的第五位賴氨酸上發現了一個104.0268道爾頓的質量偏移,并通過人工合成肽段,比較HPLC的保留時間和質譜譜圖,確定這個質量偏移是由一個苯甲酰基引起的。

酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾

?圖2.?(上)H2B第五位賴氨酸苯甲酰化的質譜鑒定及

(下)苯甲酰化泛抗體的質控

為了更好的研究苯甲酰化修飾,作者利用杭州景杰開發針對苯甲酰化修飾的泛抗體進行檢測。檢測結果顯示,該抗體可以非常靈敏的檢測到苯甲酰化修飾,而不會對賴氨酸上的其他種類的修飾產生非特異性結合(圖2下)。

2.?苯甲酰化位點的鑒定

后續的研究中,通過檢測5mM苯甲酸鈉處理的細胞與對照組的差異,作者鑒定到了共計22個組蛋白的苯甲酰化修飾位點(圖3)。令人振奮的是,幾乎所有的苯甲酰化修飾位點都集中在組蛋白的N末端區域的賴氨酸側鏈,這與廣泛分布在組蛋白的賴氨酸的乙酰化、巴豆酰化產生了強烈對比,暗示了苯甲酰化在染色質的調控中可能扮演了與眾不同的重要角色。

酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾

圖3. 組蛋白上的苯甲酰化位點分布

3.?苯甲酸鈉刺激條件下苯甲酰化修飾的動態調控

利用同位素氘標記的方法,作者確認了苯甲酸鈉確實可以刺激細胞中苯甲酰化的發生,而同時細胞的乙酰化水平僅僅略有降低(圖4)。作者同時指出,一些位點的苯甲酰化水平與乙酰化水平相當,顯示出在暴露在富含苯甲酸鈉的環境中,苯甲酰化的發生是非常普遍的。

?酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾

圖4. 苯甲酰化水平受到苯甲酸鈉濃度低影響

4.?SITR2可以在體內體外去除苯甲酰化修飾

HDAC,組蛋白去乙酰化酶是一類可以將乙酰基團從組蛋白上移除的一類酶。其中一種HDAC,SIRT2被鑒定出具有明顯的去苯甲酰化酶活性(圖5左上),并且催化過程依賴于NAD+,且可以被第三類HDAC抑制劑(例如NAM)抑制其催化活性,而不受TSA的影響(圖5右上)。作者還進一步比較了SIRT2的去乙酰化和去苯甲酰化酶活性的區別(圖5下)。

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酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾

圖5. SIRT2依賴于NAD+的去苯甲酰化修飾酶活性

5.?苯甲酰化修飾的全基因組分布

為了研究組蛋白苯甲酰化修飾在全基因組的分布情況,作者在苯甲酸鈉處理后的細胞中利用CHIP-Seq的方法鑒定到了20283個發生苯甲酰化修飾的位點,其中超過半(57.33%)的苯甲酰化修飾發生在基因的啟動子中(圖6 左上)。類似于賴氨酸的乙酰化,苯甲酰化修飾較少發生在TSS區域,而較多地發生在TSS的上下游(圖6 上中),預示著苯甲酰化在轉錄調控中扮演的重要作用,而作者對CHIP-Seq數據與基因表達水平的相關性分析支持了這一猜想(圖6 右上)。

酰化修飾新成員---與眾不同的賴氨酸苯甲酰化修飾

圖6. 苯甲酰化在基因組的分布特點及驗證

后續的生物信息學分析發現,苯甲酰化修飾相對于乙酰化修飾,主要調節甘油磷脂的代謝,卵巢甾類的合成,水解磷脂酶D的信號通路,血清素突觸以及胰島素的分泌過程。而RT-qPCR也驗證了這些結論(圖6 下)。



總結



作為賴氨酸上的新型酰化修飾,苯甲酰化修飾顯得與眾不同,它是已知的發生在賴氨酸上的唯一含有苯環的修飾,其修飾基團較大(是乙酰化的2倍)且有較強的疏水性(是乙酰化的3倍)。

組蛋白通過乙酰化調節與DNA的相互作用進而調控基因的表達水平,而擁有更加顯著結構影響力的苯甲酰化修飾可以預見對基因的調控作用會更加明顯,作者猜測有蛋白質能夠特異性識別苯甲酰化修飾并影響基因的表達及染色質的構型。

此外,苯甲酰化修飾可能廣泛分布在蛋白質組中,在非組蛋白的功能調控中也發揮著潛在的重要作用。作為食品添加劑和藥品的苯甲酸鈉,會在攝入后引起轉錄反應,該研究為苯甲酸鈉的毒性功能提出了分子機制探究上的線索。

發現新的蛋白質翻譯后修飾,作為一線科研工作者的我們應該怎么趕上這班車?景杰生物作為首個擁有泛苯甲酰化修飾抗體并可開展苯甲酰修飾組學的公司,可以助力大家進行以下方向的研究:

1.?鑒定苯甲酰連接酶和苯甲酰化酶

2.?利用泛苯甲酰修飾抗體,結合LC-MS/MS技術,研究苯甲酰修飾組學

3.?研究非組蛋白苯甲酰修飾的功能

4.?研究組蛋白苯甲酰修飾的位點特異性功能

5.?研究苯甲酰修飾的組織及位點特異性

6.?研究苯甲酸鈉及其類似衍生物對苯甲酰修飾水平的影響,以及產生的后果

7.?從苯甲酰化修飾的角度研究腸道微生物與宿主的相互作用


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